新策略：通过给体构型依赖的能量转移设计实现荧光探针的双色高分辨率成像

华东理工大学化学与分子工程学院张志云和苏建华教授课题组提出了利用构型依赖的荧光分子作为给体构建全新的荧光共振能量转移（FRET）体系。不同于传统的单发射给体，振动诱导发射(VIE)给体受光激发后分子构型可由弯曲态转变为平面态，产生具有良好光谱分离的双发射。通过连接合适的受体（如花菁染料Cy5）使VIE给体的平面化能量完全转移，从而获得具有超高双峰分辨率和超大伪Stokes位移的探针，实现了双色高分辨率成像。这项工作对设计给-受体基于的双色荧光探针具有重要的指导意义。

光致发光材料因其高的灵敏度和分辨率以及实时原位可视化的优势，在化学传感、生物成像、医学诊断等诸多领域受到了广泛的关注。基于不同荧光团设计的强度依赖型探针在实际应用中往往会受到探针自身和周围环境的影响，包括探针浓度和分布、光漂白、激发光源、微环境(pH值、极性和温度)的变化。相比之下，比率荧光探针通过测量两个不同通道的荧光强度，可以很好地避免上述问题。特别地，随着荧光成像技术的迅猛发展，一种新的Lambda实彩成像模式正在受到青睐。通过一次扫描，Lambda成像模式即可获得接近于真实荧光颜色的图像，从而提供更为直观和清晰的标记信息。基于这一成像模式，高双峰分辨率的比率荧光探针在双色成像方面具有广阔的发展前景。

荧光共振能量转移(FRET)是设计比率荧光探针的有效策略。然而，受给体发射需与受体吸收具有高度光谱重叠的刚性要求，传统FRET体系的双峰光谱分辨率受到严重限制(通常小于100 nm)。而且，频繁使用的FRET给体如香豆素、BODIPY、荧光素和罗丹明等只有极小的Stokes位移(小于30 nm)，不可避免受到由自吸收和激发后散射效应导致的荧光检测误差。截止目前，开发新的FRET体系以打破上述限制仍是一项富有挑战性的工作。

VIE荧光团是由该课题组所在的田禾院士团队报道的一类新型的构象依赖的发光材料。受激发后，这类分子的构型发生罕见的从弯曲态到平面态的转变，导致π-离域和Stokes位移的显著增加，同时构象转变也带来了独特的环境依赖的双发射。在本工作中，该课题组利用VIE荧光团作为给体来构建全新的FRET体系。不同于传统的FRET给体只有单个发射和小Stokes位移，VIE给体具有本征的双发射和更大的Stokes转移。如图1所示，通过连接适当的受体，VIE给体平面化的能量能够被完全吸收，而弯曲的能量几乎不受影响。选择常用的花青素染料(Cy5)作为受体，本工作成功构建了VIE-FRET体系（PPCy5）。

图1. VIE-FRET体系的设计原理及合成的探针。

由于VIE给体的平面化发射可以完全地与Cy5的吸收交叠（图2a），PPCy5最终展现来自VIE给体的短波发射和来自Cy5的长波发射（图2b），实现了长达142 nm的双峰光谱差和300 nm的超大伪Stokes位移。受VIE给体的黏度依赖性，PPCy5在双色模式下可以清晰且直观地观察到活细胞内不同黏度的分布，而单独的给体或受体则无法做到这一点（图3）。因此，VIE-FRET策略为未来设计具有双色高分辨率成像和长波发射的荧光探针提供了一种全新的途径。

图2.（a）给体吸收、发射（400 nm激发）和受体吸收光谱交叠；（b）给体、受体和VIE-FRET体系在400 nm激发下的发射光谱。

图3. VIE-FRET体系在405 nm激发下的实彩成像（a）和原位荧光光谱（b），受体Cy5分别在405 nm（c）和633 nm（d）激发下的实彩成像。 

相关研究结果近期在线发表在Science China Chemistry上。论文第一作者为华东理工大学化学与分子工程学院郭丽方博士，通讯作者为张志云特聘研究员。详见：Lifang Guo, Xin Jin, Hao Liu, Jiangnan Zhu, Zhiyun Zhang* Jianhua Su. Donor-conformation-dependent energy transfer for dual-color fluorescent probe with high-resolution imaging. Sci. China Chem., 2021, doi:10.1007/s11426-021-9979-1.

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通讯作者简介

张志云 华东理工大学化学与分子工程学院特聘研究员，博士生导师。2013年3月于华东理工大学获博士学位；随后赴中国台湾大学化学系和美国达特茅斯学院化学系从事博士后研究；2018年9月入职华东理工大学。研究方向为有机π共轭荧光材料化学，重点聚焦共轭分子发光构效关系的研究。在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Energy Environ. Sci.、Chem. Sci.、Adv. Funct. Mater.等期刊上发表SCI收录论文39篇。

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